Características y peculiaridades de la prueba lisa

Se llama técnica ELISA.
La técnica de Elisa es un procedimiento de ensayo inmunoenzimático cuyo nombre resulta de la asociación de las iniciales de su denominación inglesa (enzyme linked inmuno sorbent assay). Como todo ensayo inmunoenzimático, la prueba recurre al empleo de inmunógenos, haptenos o anticuerpos marcados con una enzima, para revelar el reactivo complementario a nivel de distintos fluidos biológicos.
Fue concebida independientemente en 1971 en Suecia y Holanda, siendo aplicada posteriormente a la revelación y a la cuantificación de los más diversos tipos de sustancias presentes en líquidos orgánicos (antígenos, anticuerpos, hormonas, fármacos, etc.).
El área de sus aplicaciones médicas se ha expandido en forma sostenida, siendo utilizada como el primer sustituto de la técnica de Radioinmunoensayo* en la medición de hormonas, inmunoglobulinas, antígenos y anticuerpos en infecciones bacterianas, micósicas, parasitarias o virósicas.
De un modo general se procede a la fijación de uno de los componentes de la reacción inmunológica (antígeno Ag o anticuerpo Ac) a un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario. El complejo inmunológico formado es enfrentado luego a las moléculas capaces de reconocer a su componente más superficial, marcadas con una enzima (peroxidasa de rábano picante); agregándose posteriormente un sustrato cromogénico de la enzima marcadora. La existencia de una reacción inmunológica se demuestra y se cuantifica midiendo espectrofotométricamente la cantidad de producto enzimático resultante.
Tipos de técnicas Elisa:
Técnicas cualitativas:
Son técnicas Elisa que nos indican la ausencia o presencia de un antígeno o anticuerpo determinando. Los kits incluyen controles positivos y negativos para poder determinar esta presencia o ausencia de antígenos.
Ejemplo: HIV, Hepatitis, etc.
Técnicas cuantitativas:
Son técnicas Elisa que nos indican la cantidad de antígeno o anticuerpo presente en la muestra. Los kits incluyen +/-6 standards (sueros de diferentes concentraciones del antígeno objetivo) con los cuales se realiza una curva para así poder determinar la concentración de la muestra.
Ejemplo: Hormonas, Marcadores tumorales, etc.
Técnicas semi-cuantitativas:
Son técnicas Elisa que nos dan un indicio de la cantidad de antígeno o anticuerpo presente en la muestra con la utilización de un standard o calibrador
Ejemplo: ANA, nDNA, etc.
Más sobre esta técnica:
La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal : es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas,...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos : diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc..
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes :
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sándwich, etc.. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.
3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.
4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.
Tipos de ensayos ELISA
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ej. en el clonaje de anticuerpos monoclonales), o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.
ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, ...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).
ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.
ELISA 'sandwich'. (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
Ejemplos de aplicaciones de esta técnica:
Aplicaciones:
Screening de Enfermedades Infecciosas
- Hepatitis
- HIV
- Clamidia
- CMV
- Herpes
- Sífilis
- Gonorrhea
- Human Papilloma Virus
- Clostridium
- Salmonella
- Legionela
- Shigella
- Campylobacteria
- EB virus
- Malaria
- Toxoplasmosis
Ensayos Hormonales por ELISA
Progesterona
Estrógeno
HCG
Prolactina
LH
FSH
Testosterona
LDH
TSH
Tiroxina
T3
T4
Insulina
Adrenalina
Cortisol

Gracias por la contestación. Pero enhtonces, ¿se puede utilizar esta prueba para ver si los anticuerpos o los componentes del sistema inmune están funcionando normalmente? ¿Cómo para ver si los receptores de la membrana de los linfocitos B están funcionando adecuadamente luego de someter los linfocitos B a cierto tratamiento?