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Respuesta de natagrobas
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Siento no haberte contestado antes pero tuve problemas para entrar en la página de todoexpertos.
El westernblot es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas con base en su capacidad para unirse a anticuerpos específicos.
Éste se basa esencialmente en separar las principales estructuras del virus en un gel de poliacrilamida, mediante la aplicación de corriente eléctrica la cual hace correr estas proteínas y glicoproteínas de acuerdo a su peso molecular. Una vez separadas, son transferidas a un papel de nitrocelulosa donde se agrega el suero en estudio y si éste tiene anticuerpos contra las estructuras virales nos daremos cuenta por la presencia de bandas.
Los resultados que nos informa el laboratorio son tres: un resultado positivo es cuando aparecen múltiples bandas, un resultado negativo es cuando no aparece ninguna banda y un resultado indeterminado es cuando sólo aparece alguna o algunas bandas pero que no son suficientes para ser considerado como positivo. Esto puede ser debido a que se trata de: 1) infección en etapa temprana, 2) ¿Infección con el VIH?2, ya que comparten algunas proteínas y otras son totalmente distintas o 3) se trate de una reacción inespecífica.
El protocolo de esta técnica o su procedimiento es el siguiente:
1. Prepara la membrana y corre la electroforesis.
2. Al terminar la electroforesis, equilibra la gel en el amortiguador de transferencia por 15 min.
3. Mientras, moja la membrana (Immobilon-P) en metanol 100% por 1-3 segundos. Luego sumérjala en agua por 1-2 min. Equilibre la membrana en el electroblotting buffer. La membrana ya está lista para transferirla.
4. Coloque la gel en el aparato (Mini Protean Transfer Blot) con la membrana hacia el ánodo
(+, rojo)
5. Transfiere por una hora a 100 V.
Nota: El procedimiento se puede parar aquí. La membrana se puede secar al aire libre. Antes de bloquearla se debe hidratar poniéndola en metanol 100% por 1-3 s y lavándola en agua.
6. Bloquee la membrana con el amortiguador de bloqueo por una hora a temperatura de salón.
7. Lave tres veces con la solución de lavado por 10 min. a temperatura de salón.
8. Diluye el anticuerpo primario (diluciones sugeridas 1:100 ó 1:200) en el amortiguador de bloqueo, incube a 37°C por 30 min., luego a temperatura de salón por 1 hora.
9. Lave como en el paso 7.
10. Diluye HRPO-anti Ig en el amortiguador de bloqueo (1:200) e incube con la membrana por 1 hora a temperatura de salón.
11. Lave como en el paso 7.
12. Lave 2 veces con (1X) Tris-Saline por 10 min.
13. Añade la solución de sustrato y permita que desarrolle hasta un color marrón.
14. Detenga la reacción con agua.
Se utiliza generalmente para el diagnóstico del SIDA. También se utiliza para diagnosticar la presencia del parásito Trypanosoma cruzi, para diagnosticar el Hantavirus... Pero donde más se utiliza es para diagnosticar la presencia de VIH, como ya te he dicho anteriormente.
El westernblot es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas con base en su capacidad para unirse a anticuerpos específicos.
Éste se basa esencialmente en separar las principales estructuras del virus en un gel de poliacrilamida, mediante la aplicación de corriente eléctrica la cual hace correr estas proteínas y glicoproteínas de acuerdo a su peso molecular. Una vez separadas, son transferidas a un papel de nitrocelulosa donde se agrega el suero en estudio y si éste tiene anticuerpos contra las estructuras virales nos daremos cuenta por la presencia de bandas.
Los resultados que nos informa el laboratorio son tres: un resultado positivo es cuando aparecen múltiples bandas, un resultado negativo es cuando no aparece ninguna banda y un resultado indeterminado es cuando sólo aparece alguna o algunas bandas pero que no son suficientes para ser considerado como positivo. Esto puede ser debido a que se trata de: 1) infección en etapa temprana, 2) ¿Infección con el VIH?2, ya que comparten algunas proteínas y otras son totalmente distintas o 3) se trate de una reacción inespecífica.
El protocolo de esta técnica o su procedimiento es el siguiente:
1. Prepara la membrana y corre la electroforesis.
2. Al terminar la electroforesis, equilibra la gel en el amortiguador de transferencia por 15 min.
3. Mientras, moja la membrana (Immobilon-P) en metanol 100% por 1-3 segundos. Luego sumérjala en agua por 1-2 min. Equilibre la membrana en el electroblotting buffer. La membrana ya está lista para transferirla.
4. Coloque la gel en el aparato (Mini Protean Transfer Blot) con la membrana hacia el ánodo
(+, rojo)
5. Transfiere por una hora a 100 V.
Nota: El procedimiento se puede parar aquí. La membrana se puede secar al aire libre. Antes de bloquearla se debe hidratar poniéndola en metanol 100% por 1-3 s y lavándola en agua.
6. Bloquee la membrana con el amortiguador de bloqueo por una hora a temperatura de salón.
7. Lave tres veces con la solución de lavado por 10 min. a temperatura de salón.
8. Diluye el anticuerpo primario (diluciones sugeridas 1:100 ó 1:200) en el amortiguador de bloqueo, incube a 37°C por 30 min., luego a temperatura de salón por 1 hora.
9. Lave como en el paso 7.
10. Diluye HRPO-anti Ig en el amortiguador de bloqueo (1:200) e incube con la membrana por 1 hora a temperatura de salón.
11. Lave como en el paso 7.
12. Lave 2 veces con (1X) Tris-Saline por 10 min.
13. Añade la solución de sustrato y permita que desarrolle hasta un color marrón.
14. Detenga la reacción con agua.
Se utiliza generalmente para el diagnóstico del SIDA. También se utiliza para diagnosticar la presencia del parásito Trypanosoma cruzi, para diagnosticar el Hantavirus... Pero donde más se utiliza es para diagnosticar la presencia de VIH, como ya te he dicho anteriormente.
