Ingeniería genética en medicina

En el caso que expone, el procedimiento habitual y más sencillo sería conseguir una muestra del tejido que expresa dicha proteína y aislar el RNA mensajero que la codifica. Ese RNA mensajero (mRNA) se pasaría a DNA (cDNA) y se clonaría en un vector de expresión para bacterias. El motivo de usar el mRNA se debe a que la mayoría de genes en eucariotas (los organismos que tienen células con núcleo diferenciado) son genes en los cuales la región codificadora se encuentra fragmentada en porciones separadas por secuencias que no codifican (intrones), las cuales se eliminan al sintetizar el mRNA. Por ello, es mejor usar una copia de ese mRNA en lugar del gen original que se encuentra en el genoma.

Los vectores de expresión en bacterias son unas cadenas circulares de DNA llamadas plásmidos, que se expresan y replican al margen del cromosoma de la bacteria, y que se manipulan para que contengan un promotor "fuerte", es decir, la secuencia que va antes de la región codificadora y que indica cuando y con qué intensidad debe la bacteria expresar dicho gen, y un gen de resistencia a un antibiótico, para poder seleccionar después las bacterias que lo han incorporado, y que serán las únicas que podrán crecer en un medio con dicho antibiótico. El cDNA que codifica para la proteína que nos interesa también deberíamos manipularlo para eliminar toda aquella región que la bacteria no "entienda". Por ejemplo, todos los mRNA tienen una región anterior y posterior que no codifican, que conviene acortar al máximo, y las proteínas que van destinadas a realizar su función en el exterior de la célula contienen una secuencia de aminoácidos en el inicio llamada "péptido señal", que la célula eucariota elimina al sacar a la proteína fuera, pero que la bacteria no "entenderá" ni eliminará. Esta eliminación se suele realizar, cuando es posible, por corte por enzimas de restricción de tipo II, unos enzimas que reconocen una secuencia específica del DNA y cortan ambas cadenas en una posición definida. Si no es posible hacerlo con enzimas de restricción, puede hacerse por una técnica llamada "mutagénesis in vitro", y que consiste en introducir cambios en la secuencia durante la replicación "in vitro" del fragmento.

Una vez se ha clonado el cDNA en el vector de expresión, mediante el corte con las enzimas de restricción apropiadas y la religación con una ligasa de DNA (todo ello "in vitro"), se introduce el vector en una cepa bacteriana debidamente tratada, mediante un proceso llamado "transformación", en el cual el vector pasa al interior de la bacteria al inducir un shock térmico. Después de seleccionar las bacterias que han incorporado el vector en un medio con antibiótico, sólo resta hacer cultivos líquidos grandes de dicha cepa bacteriana para proceder luego a la purificación de la proteína a partir de un lisado (rotura de las células) del cultivo. Esto puede hacerse en unos tanques grandes llamados fermentadores, para producir a gran escala.